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Vorrei iniziare con un promemoria che spesso si perde nei dibattiti pubblici: i vaccini a mRNA contro il Covid sono prodotti medici davvero innovativi.
Prima delle autorizzazioni di emergenza del 2020, la tecnologia dei vaccini a mRNA non era mai stata implementata su larga scala negli esseri umani. Solo due studi clinici, uno di Pfizer-BioNTech e uno di Moderna, avevano testato questa piattaforma sugli esseri umani. Complessivamente, circa 37,000 individui avevano ricevuto un vaccino a mRNA nella storia della medicina (esclusa la precedente esperienza con i vaccini contro la rabbia, il CMV e il cancro, limitata a studi di fase iniziale molto più piccoli). Questa non è una critica; è semplicemente una constatazione di fatto. Ma significa che il profilo di sicurezza a lungo termine di questi prodotti era, e rimane, incompleto.
Quanto segue è familiare a quasi tutti i biologi molecolari. È complicato, ma cerco di semplificarlo, data la posta in gioco. È importante esporre chiaramente il quadro molecolare a tutti, perché il modo in cui questi vaccini vengono prodotti determina direttamente cosa c'è all'interno della fiala.. Una volta iniettato, il contenuto della fiala si diffonderà in tutto il corpo, innescando una serie di eventi che possono avere conseguenze a lungo termine sulla salute.
La trascrizione in vitro non è solo un dettaglio di produzione
I vaccini mRNA modificati vengono prodotti utilizzando un processo chiamato trascrizione in vitro (IVT))L'IVT è il metodo utilizzato per sintetizzare l'mRNA modificato che alla fine diventa il principio attivo del vaccino.
Non si tratta di un dettaglio banale. L'IVT influenza in modo fondamentale la composizione molecolare del prodotto finale.
Gli scienziati di BioNTech, compresi quelli direttamente coinvolti nello sviluppo del vaccino Pfizer, hanno pubblicato una revisione dettagliata1 descrivendo come le reazioni IVT generino non solo l'mRNA completo previsto, ma anche una serie di sottoprodotti e impurità, come questi vengano tipicamente rimossi e quali potrebbero essere le loro conseguenze biologiche se persistono. Queste istruzioni di produzione, insieme ai sottoprodotti che creano, sono state descritte in dettaglio anche da Moderna nei suoi brevetti (US10,653,712 B2 e US10,077,439 B2). Ma, cosa ancora più importante, questa biologia molecolare era ben consolidata ben prima del Covid. Niente di tutto ciò è speculativo.
Il materiale di partenza: i modelli di DNA
In sostanza, una reazione IVT inizia con il DNA a doppio filamento che codifica la proteina desiderata. In questo caso, la proteina spike del SARS-CoV-2.
La sequenza di codifica spike utilizzata nei vaccini a mRNA è geneticamente modificati per migliorare la stabilità e la tolleranza cellulare, comprese due sostituzioni di aminoacidi che lo rendono diverso dalla proteina spike virale. Tale modifica è intenzionale.
Il modello di DNA stesso può assumere forme diverse. Durante i primi studi clinici di Pfizer, venivano utilizzati frammenti di DNA generati tramite PCR. Tuttavia, il processo di produzione commerciale si basava su DNA derivato da plasmidi. Questo è importante perché i plasmidi contengono sequenze regolatrici aggiuntive. Nel caso di Pfizer, queste includono elementi come il promotore SV40 e le sequenze ori, che sollevano preoccupazioni in caso di penetrazione nelle cellule umane.
Una volta aggiunto questo modello di DNA alla reazione IVT, insieme all'RNA polimerasi e ad altri componenti, viene trascritto in mRNA (Figura 1).
IVT produce sottoprodotti tramite progettazione
Mentre il risultato desiderato dell'IVT è il prodotto mRNA completo previsto, il risultato effettivo è più complesso. Questi includono vari sottoprodotti sotto forma di (1) diverse specie di RNA, tra cui l'RNA a doppio filamento (dsRNA), (2) DNA legato all'RNA (ibridi RNA-DNA) e (3) il DNA libero dal modello originale (Figura 2).
La formazione di questi sottoprodotti è ben documentata e inevitabile ed è per questo che la purificazione a valle è assolutamente essenziale per la sicurezza.
Figura 2. Sottoprodotti e contaminanti della produzione di IVT. Immagine adattata da 1.
La purificazione ha limiti noti
Dopo la produzione sono necessari due passaggi di purificazione per rimuovere prima il DNA e poi i sottoprodotti dell'RNA (Figura 3):
Figura 3. Rimozione dei sottoprodotti IVT. Immagine adattata da 2.
Per rimuovere il DNA, alla miscela di reazione viene aggiunto un enzima chiamato DNasi I, comunemente utilizzato per degradare il DNA contaminante. Sebbene la DNasi I sia efficace contro il DNA stampo libero, diversi studi, inclusi quelli condotti dagli stessi scienziati di BioNTech, dimostrano che è inefficiente nel rimuovere il DNA legato all'RNA (ibridi RNA-DNA).
Questa limitazione non è controversa ed è documentata in letteratura.
Cosa hanno dimostrato le analisi indipendenti
Questo contesto è fondamentale per interpretare le recenti analisi indipendenti delle fiale di vaccino finite.
Ricercatori3 e regolatori4 hanno segnalato il rilevamento di contaminanti del DNA in praticamente ogni fiala testata. Questi contaminanti includevano sia DNA a doppio filamento che ibridi RNA-DNA che apparivano resistenti alla digestione con DNasi I.
In alcuni campioni, il DNA codificante per la proteina spike era presente a livelli più di 100 volte superiori rispetto ad altre sequenze plasmidiche5, suggerendo una digestione irregolare o incompleta. Il sequenziamento e le analisi PCR quantitative hanno inoltre rilevato frammenti di DNA di lunghezza media di circa 200 coppie di basi, con alcuni che superavano le 4 kilobasi. In diversi casi, sono state osservate sequenze che si estendevano quasi per l'intero plasmide.
Nel complesso, questi risultati sollevano seri interrogativi sulla coerenza e la completezza della purificazione durante la produzione su larga scala e sulle potenziali conseguenze biologiche degli acidi nucleici residui negli esseri umani.
Perché i contaminanti degli acidi nucleici sono importanti dal punto di vista biologico
RNA e DNA sono potenti attivatori delle vie immunitarie innate. Non si tratta di speculazioni. I recettori di riconoscimento dei pattern e la via cGAS-STING rispondono in modo efficace agli acidi nucleici estranei, innescando infiammazione, inibizione della crescita e persino morte cellulare.
Questi meccanismi sono esattamente il motivo per cui i prodotti di terapia genica sono soggetti a rigorosi controlli di sicurezza.
Ironicamente, i vaccini a mRNA contro il Covid sono stati progettati con modifiche specifiche per ridurre questa potente attivazione immunitaria innata. Ma gli ibridi RNA-DNA e i frammenti di DNA provocheranno comunque forti risposte immunitarie nonostante tali modifiche.
La persistenza solleva nuove domande
Esistono ormai prove sostanziali che dimostrano che l'mRNA e la proteina spike persistono nei tessuti umani per settimane, mesi e persino anni dopo la vaccinazione (Tabella 1).
Non sappiamo ancora se questa persistenza rifletta una prolungata stabilità dell'mRNA, una traduzione continua o meccanismi basati sul DNA. Tuttavia, data la plausibilità dell'integrazione del DNA e la lunga vitalità del DNA plasmidico non integrato nelle cellule muscolari,6 non è irragionevole supporre che la persistenza dell'mRNA, della proteina e degli anticorpi contro Spike anni dopo la vaccinazione non sia estranea alle impurità e ai sottoprodotti del DNA in seguito alla vaccinazione in vitro.
Tabella 1. Persistenza dell'mRNA e delle proteine spike dopo la vaccinazione negli esseri umani
Implicazioni sulla sicurezza a breve e lungo termine
Nel complesso, questi dati sollevano diverse importanti considerazioni sulla sicurezza.
In primo luogo, sono state segnalate reazioni immunitarie acute, tra cui tempeste citochiniche e anafilassi, subito dopo la vaccinazione. Risposte infiammatorie così intense non devono essere liquidate a priori come non correlate alle impurità, soprattutto alla luce di quanto si sa sull'attivazione immunitaria indotta dagli acidi nucleici.
In secondo luogo, e più criticamente, ci sono i rischi a lungo termine. L'espressione persistente di spike potrebbe plausibilmente contribuire a sindromi immunitarie croniche. Ancora più preoccupante è la possibilità di integrazione del DNA, che comporta rischi di mutagenesi inserzionale o di alterazione genetica. Ciò comporta un rischio di cancro o difetti dello sviluppo a seconda di dove e a quale età il DNA è stato integrato.
In particolare, la FDA stessa afferma nei suoi fogli informativi che questi vaccini non sono sono stati valutati per la cancerogenicità (formazione di cancro) o la genotossicità (danno al DNA), un punto che sarebbe di routine e previsto nella supervisione della terapia genica, dove il monitoraggio a lungo termine è standard.
Il divario normativo relativo al DNA nei vaccini a mRNA
Poiché non vi è più alcun dubbio sull'esistenza di DNA residuo nei vaccini a mRNA, la questione è se le attuali linee guida e i limiti di sicurezza siano appropriati per i vaccini a mRNA. Ci è stato assicurato che i sottoprodotti del DNA rientrano nei limiti stabiliti dalle linee guida normative. Quali sono quindi le linee guida della FDA in merito ai sottoprodotti del DNA e ai contaminanti?
Le linee guida FDA più comunemente citate sul DNA residuo (≤10 ng per dose) sono state sviluppate per vaccini virali prodotti in cellule viventi, frammentate e "nude", con una capacità limitata di penetrare nelle cellule umane. Tuttavia, i vaccini a mRNA non vengono prodotti nelle cellule, il loro DNA residuo non deriva dalle cellule ospiti e, soprattutto, il DNA nei vaccini a mRNA non è nudo. È associato a sistemi di somministrazione LNP, che specificamente facilitano l'ingresso del DNA all'interno delle cellule. Le linee guida FDA del 2010 sono chiare nel dire che non stabiliscono una soglia di sicurezza rilevante per il DNA associato ai prodotti a base di LNP.
L'altra guida comunemente citata è quella dell'OMS per le terapie proteiche ricombinanti che agiscono sul DNA residuo in prodotti come anticorpi monoclonali o ormoni prodotti in cellule ingegnerizzate. Anche in questo caso, il DNA residuo proviene da cellule ospiti o plasmidi di espressione, è presente come traccia, DNA non incapsulato (nudo) e il prodotto finale è una proteina purificata, non una terapia a base di acidi nucleici (vaccino a mRNA). Pertanto, queste linee guida non si applicano ai vaccini a mRNA.
Né la FDA né gli standard normativi dell'OMS più spesso citati per il DNA residuo sono stati sviluppati per i vaccini a mRNA e non affrontano direttamente questo problema di sicurezza.
Cosa ha detto l'OMS sui vaccini a mRNA dopo la loro implementazione
Nel 2022, l'Organizzazione Mondiale della Sanità ha pubblicato delle linee guida specifiche per i vaccini a mRNA7In particolare, questo documento è stato rilasciato dopo il lancio globale di questi prodotti. Afferma specificamente che questa guida è stata redatta in risposta a: "le problematiche di sicurezza, produzione e regolamentazione associate a questa nuova tecnologia.” Il documento contiene anche alcune affermazioni importanti:
"Poiché non sono ancora disponibili informazioni dettagliate sui metodi utilizzati per la produzione, i controlli non sono ancora standardizzati per vaccini mRNA sicuri ed efficaci e alcuni dettagli rimangono proprietari e quindi non disponibili al pubblico, al momento non è possibile sviluppare linee guida o raccomandazioni internazionali specifiche."
Afferma inoltre: “Le procedure dettagliate di produzione e controllo...dovrebbero essere discusse e approvate dalla NRA [Autorità Nazionale di Regolamentazione] caso per caso."
L'OMS riconosce che i controlli per i vaccini a mRNA non erano ancora standardizzati e che non era possibile stabilire linee guida o raccomandazioni internazionali specifiche. Inoltre, è necessaria una supervisione normativa per la valutazione caso per caso da parte delle autorità nazionali.
Ciò è stato affermato dopo che i vaccini a mRNA erano stati distribuiti.
Al momento in cui scrivo questo Substack, la FDA non ha ancora stabilito linee guida standardizzate per i vaccini a mRNA né fornito prove e dati basati sulla sicurezza a supporto di eventuali limiti del DNA nei vaccini a mRNA.
Infine, vale la pena ripeterlo: sebbene la tecnologia mRNA non sia una novità, prima del Covid era regolamentata come terapia genica, non come vaccino tradizionale. I problemi di sicurezza relativi ai sottoprodotti del DNA nei vaccini contro il Covid saranno gli stessi di qualsiasi vaccino mRNA, compresi quelli per l'influenza, il virus respiratorio sinciziale (RSV) o persino i vaccini mRNA per il cancro.
Questo perché i prodotti di mRNA sono fondamentalmente diversi. Devono entrare nelle cellule e istruirle a produrre una proteina estranea. Questo è diverso da qualsiasi altro vaccino convenzionale che rilascia la proteina direttamente. Non esiste un precedente clinico per questa piattaforma, né per la somministrazione ripetuta. E certamente nessun precedente su scala di popolazione.
In questa fase, senza una pandemia, con l'accumulo di dati meccanicistici e osservazioni cliniche e con la proliferazione di prodotti vaccinali a mRNA che arrivano sul mercato, abbiamo bisogno di trasparenza e di un impegno diretto con studi seri sulla sicurezza da parte degli enti regolatori, in particolare la FDA, che stabilisce linee guida fondamentali per la produzione di questi prodotti, soprattutto per quanto riguarda i sottoprodotti del DNA.
Le nuove tecnologie richiedono un nuovo esame, non silenzio, manipolazione o censura.
Referenze
1 https://www.frontiersin.org/journals/molecular-biosciences/articles/10.3389/fmolb.2024.1426129/full
2 Webb C, Ip S, et al Mol Pharm. 4 aprile 2022;19(4):1047-1058. doi: 10.1021/
3 https://www.tandfonline.com/doi/10.1080/08916934.2025.2551517?url_ver=Z39.88-2003&rfr_id=ori:rid:crossref.org&rfr_dat=cr_pub%20%200pubmed
4 https://www.tga.gov.au/resources/publication/tga-laboratory-testing-reports/summary-report-residual-dna-and-endotoxin-covid-19-mrna-vaccines-conducted-tga-laboratories.
5 https://zenodo.org/records/17832183; https://www.scstatehouse.gov/CommitteeInfo/SenateMedicalAffairsCommittee/PandemicPreparedness/Phillip-Buckhaults-SC-Senate-09122023-final.pdf
6 Wang et al. (2004) – “Rilevamento dell'integrazione del DNA plasmidico nel DNA genomico dell'ospite dopo iniezione intramuscolare ed elettroporazione” (Gene Therapy, 2004). Nei topi, il DNA plasmidico nudo è stato iniettato per via intramuscolare, seguito da elettroporazione per migliorarne l'assorbimento. Utilizzando una PCR altamente sensibile su DNA genomico purificato (con separazione su gel per rimuovere le forme extracromosomiche), gli autori hanno identificato quattro eventi di integrazione indipendenti a 4 settimane dall'iniezione. Il sequenziamento delle giunzioni ha confermato siti di integrazione casuali (nessun hotspot preferenziale), compatibili con una giunzione delle estremità non omologa. La frequenza di integrazione era bassa ma misurabile. Questa è una delle dimostrazioni più chiare di eventi di integrazione spontanea in vivo per il DNA plasmidico nudo nel muscolo. Da notare: questo studio ha utilizzato un rilascio di DNA potenziato tramite elettroporazione, paragonabile al rilascio potenziato tramite LNP.
Martin et al. (1999) – “Vaccino antimalarico a DNA plasmidico: il potenziale di integrazione genomica dopo iniezione intramuscolare” (Human Gene Therapy). Questo studio precedente ha testato il DNA plasmidico IM nei topi e ha utilizzato l'ibridazione Southern blot e la PCR su DNA genomico ad alto peso molecolare per sondare l'integrazione. Sebbene la persistenza fosse principalmente extracromosomica, hanno riportato evidenze suggestive di una rara integrazione in alcuni campioni (sebbene non sequenziate in modo così definitivo come lavori successivi). Ha stabilito un punto di riferimento per il basso rischio, ma ha riconosciuto il potenziale per eventi a bassissima frequenza, influenzando le successive linee guida della FDA sui vaccini a DNA.
Ledwith et al. (2000) – “Vaccini a DNA plasmidico: studio dell'integrazione nel DNA cellulare dell'ospite dopo iniezione intramuscolare nei topi” (Intervirology). Il DNA plasmidico nudo iniettato per via intramuscolare nei topi ha mostrato e, sebbene non sia stata osservata alcuna integrazione rilevabile, il DNA è stato comunque rilevato nel muscolo quadricipite fino a 26 settimane. Il DNA era extracromosomico.
7 Comitato di esperti dell'OMS sulla standardizzazione biologica, 74° rapporto, Allegato 3. Valutazione della qualità, sicurezza ed efficacia dei vaccini a RNA messaggero per la prevenzione delle malattie infettive: considerazioni normative https://cdn.who.int/media/docs/default-source/biologicals/vaccine-standardization/annex-3—mrna-vaccines_who_trs_1039_web-2.pdf
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La Dott.ssa Charlotte Kuperwasser è una Professoressa di spicco presso il Dipartimento di Biologia dello Sviluppo, Molecolare e Chimica della Tufts University School of Medicine e Direttrice del Tufts Convergence Laboratory presso la Tufts University. La Dott.ssa Kuperwasser è riconosciuta a livello internazionale per la sua competenza nella biologia della ghiandola mammaria, nel cancro al seno e nella prevenzione. È membro del Comitato Consultivo sulle Pratiche di Immunizzazione.
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